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怎样进行丁酸菌和己酸菌的分离培养?
来源: | 作者:niang.pro | 发布时间: 2021-01-22 | 514 次浏览 | 分享到:
  己酸菌和丁酸菌是嫌气性的梭状芽抱杆菌。当培养这些菌时,首先要驱除培养容器中的大量空气,一般有抽气法和化学除气法两种。空气对梭状芽孢杆菌孢子的毒性很大,孢子一旦发芽成为营养体后,空气对其毒性就小了。这两类细菌已广泛地应用于浓香型曲酒和液态法白酒生产,主要发酵产物为丁酸和己酸。
  1.丁酸菌的分离培养
  (1)实验材料
  ①菌种:分离源为浓香型曲酒发酵窖泥。
  ②培养基:
  a.葡萄糖豆芽汁:葡萄糖5g, 豆芽汁100ml, 于58.84kPa下, 灭菌15min。
  b.碳酸钙萄糖豆芽汁:葡萄糖10g加人100ml豆芽汁中, 于58.84kPa下灭菌15min,然后加入5g已干热灭菌的CaCO3, 常压灭菌30min。
  c.葡萄糖牛肉汁:
  葡萄糖 30g 牛肉汁(或牛肉膏) 15g(8g)
  蛋白胨 0.15g 氯化铁     0.5g
  氧化钠 5g  磷酸氢二钾    1g
  硫酸镁 0.1g
  水   1000ml 58.84kPa,灭菌15min
  (2)操作步骤
  ①将装有葡萄糖豆芽汁的三角瓶置于火上,去塞煮沸片刻,掷人客泥少许.继续煮沸4-5min。去火, 加塞冷却至35℃, 培养2天, 用厌氧法分离, 镜检细菌形状及大小。
  ②将分离到的丁酸菌接种子碳酸钙葡萄糖豆芽汁中,称瓶重。40℃下培养14天后,再称瓶重,瓶的减轻量是因生成氢气及CO2所致。瓶的减轻量越大,说明该瓶内的细菌发酵力越强。
  ③取发酵液5ml、滤纸过滤, 将滤液2ml加人小型试管中, 再加CuCl2-HCl液0.5ml,混合均匀,加氯仿1ml.用指压管口上下翻动10次,摇匀,然后静置于试管架上。管口液体应分两层,下层为溶解丁酸铜的氯仿液。氯仿液若为无色,说明丁酸很少或没有,蓝色或绿色越浓,则说明丁酸含量越多。
  ④将含有丁酸盐的发酵液全部滤过,将洗净的滤液及洗液蒸发浓缩,丁酸钙结晶成磷片状先析出,趁热滤过,烤干、得粗丁酸钙,称重,计算每100g葡萄糖可得粗丁形钙的克数。
  (3)丁酸菌的培养
  ①试管培养:采用上述葡萄糖牛肉汁培养基,将砂土管菌种活化1-2次,于35-37℃下接人液体试管,24~36h后当液面出现一层菌膜,但无大量气泡产生时,移人三角瓶。
  ②三角瓶培养:采用上述培养基,于500ml三角瓶中装培养基250ml,灭菌,冷却后接种10%,在嫌气条件下培养,温度为35-37℃,培养24-36h。为保证嫌气条件,三角瓶口可塞一带玻璃管的橡皮塞,玻璃管的另一端通入另一个装水的三角瓶中,进行水封。
  ③卡氏罐培养:
  培养基:玉米面加麸皮10%,加水2-13倍。
  常压糊化培养基1h,冷至58~60℃,加曲10%,糖化3~4h糖化后加1%碳酸钙,0.25%硫酸铵, 浓度7~8°Bé。装入卡氏罐, 0.11MPa压力灭菌30min, 冷至35~37℃、接种10%,35-37℃水封培养24-36h。
  2.己酸菌的分离培养
  (1)分离方法
  ①培养基:
  醋酸钠 0.5%  酒精 2%(单独灭菌,接种前加入)
  硫酸镁 0.02%  硫酸铵 0.05%
  碳酸钙 1%(分消) 酵母膏 0.1%
  pH   6.8~7.0 磷酸氢二钾 0.04%
  ②种源:百年老窖泥或优质池底泥。
  ③分离方法:采用厌氧法分离。
  (2)己酸菌的扩大培养
  ①培养基:
  种子用培养基:采用上述合成培养基。
  发酵用培养基:
  酒糟浸液30% 窖泥5%
  黄浆水10%  曲粉2%
  酒精2%(或酒尾,按酒精含量折算)
  pH 5~6
  ②培养步骤:砂土管→液体试管→平底烧瓶(或三角瓶)→细口瓶→大坛(或罐)。
  每级接种量为10%,培养时间7-9天,培养温度34-36℃。
  为保证厌氧条件,每代培养基必须装满容器,高液面培养、并用酒精封口,瓶口可用塑料布包封。注意不要染菌。
  己酸菌培养易发生氨细菌污染,使发酵液变黑、恶臭,己酸产量大幅度下降。为了避免这种情况,各级培养必须严格操作,并可适当加大接种量。
  生长良好的己酸菌,可在培养液中见到较好的分层,有己酸特有的气味,产生细小的气泡(H2),表面不形成浮膜。